關(guān)鍵詞:慢病毒載體構(gòu)建，包裝，純化技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
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慢病毒載體構(gòu)建，包裝，純化技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
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測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
慢病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，具有逆轉(zhuǎn)錄病毒的基本結(jié)構(gòu)和特性：整合入宿主細(xì)胞基因組，長(zhǎng)期表達(dá)，可用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備；但也有不同于逆轉(zhuǎn)錄病毒的組份和特性：比逆轉(zhuǎn)錄病毒具有更高的滴度，不僅可以感染分裂期細(xì)胞，更重要的，還能感染非分裂期的細(xì)胞。利用慢病毒載體，可以研究啟動(dòng)子的調(diào)控、過表達(dá)特定基因或沉默特定基因。
（一） 實(shí)驗(yàn)流程（1和2為并列步驟）
1.慢病毒過表達(dá)質(zhì)粒載體的構(gòu)建
設(shè)計(jì)上下游特異性擴(kuò)增引物，同時(shí)引入酶切位點(diǎn)，PCR(采用高保真KOD酶，3K內(nèi)突變率為0%)從模板中（CDNA質(zhì)粒或者文庫）調(diào)取目的基因CDS區(qū)（coding sequence）連入T載體。將CDS區(qū)從T載體上切下，裝入慢病毒過表達(dá)質(zhì)粒載體。
2.慢病毒干擾質(zhì)粒載體的構(gòu)建
合成siRNA對(duì)應(yīng)的DNA頸環(huán)結(jié)構(gòu)，退火后連入慢病毒干擾質(zhì)粒載體
3. 慢病毒載體的包裝與濃縮純化
制備慢病毒穿梭質(zhì)粒及其輔助包裝原件載體質(zhì)粒，三種質(zhì)粒載體分別進(jìn)行高純度無內(nèi)毒素抽提，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后6 h 更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24和48h后，分別收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，病毒上清液通過超離心濃縮病毒。
(二) 實(shí)驗(yàn)材料
2.1慢病毒載體、包裝細(xì)胞和菌株
該病毒包裝系統(tǒng)為三質(zhì)粒系統(tǒng)，組成為pspax2, pMD2G, pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-shRNA2。其中質(zhì)粒上的ZsGreen1表達(dá)框能表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）。
慢病毒載體構(gòu)建包裝實(shí)驗(yàn)流程如下：
1. 根據(jù)目的基因相關(guān)信息（序列，序列號(hào)等），構(gòu)建含有外源基因或siRNA的重組載體；
2. 對(duì)于測(cè)序正確的重組質(zhì)粒，提取和純化高質(zhì)量的不含內(nèi)毒素的重組質(zhì)粒；
3. 使用高效重組載體和病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，進(jìn)行病毒包裝和生產(chǎn)，收集病毒液；
4. 濃縮、純化病毒液；
5. 用高質(zhì)量的病毒液感染細(xì)胞；
6. 通過定量PCR**測(cè)定病毒滴度（高**滴定方法）和Western 分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
7. 用高質(zhì)量的病毒液感染宿主細(xì)胞；檢測(cè)基因功能或者siRNA的沉默效率以及使用藥物進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選，通常狀況下，篩選的細(xì)胞克隆株具有長(zhǎng)期的表達(dá)穩(wěn)定性。病毒液足夠用于一般的動(dòng)物活體實(shí)驗(yàn)。