關(guān)鍵詞:細(xì)胞永生化服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
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細(xì)胞永生化服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
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測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
實(shí)驗(yàn)步驟：
1.  EB病毒液的制備
?  復(fù)蘇B95.8細(xì)胞株，使用培養(yǎng)基為10% FCS RPMI-1640
?  逐步添加培養(yǎng)基至細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期
?  細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)量為1×10^6個(gè)/ml
?  在CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)續(xù)培養(yǎng)10天，中間不換液
?  至第10天收集培養(yǎng)上清，1800rpm，4℃離心15分鐘
?  0.22μm濾器過濾，1ml/支分裝，凍存于液氮備用
2.  病人外周血液的采集、分離
①  取病人外周血4ml+4mlBSS，混勻
②  各取4ml緩慢加入含有3ml淋巴細(xì)胞分離液Ficoll PLUS-Paque（GE Healthcare Bio-Sciences貨號(hào):71716700,使用前，充分混勻）的10ml離心管中（分兩管進(jìn)行）
③  400g，18℃，離心30min
④  小心吸取上層血漿，保存?zhèn)溆?，避免擾動(dòng)細(xì)胞。
⑤  小心吸取淋巴細(xì)胞層至新的15ml離心管中
⑥  加入6mlBSS，以吸管輕輕重懸細(xì)胞
⑦  100g，18℃，離心10min，棄上清
⑧  以8mlBSS再次洗滌一遍，離心，棄上清（重懸同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)）
(一般1ml血能分離出1×10^6個(gè)細(xì)胞，故4ml血約有4×10^6個(gè)細(xì)胞)
3.  EB病毒轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞
①  取EBV上清1ml重懸上述細(xì)胞，37℃水浴，2h，20min晃動(dòng)一次
②  加入3ml 20％FBS-1640全培，含0.2 μg/ml cyclosporin A （環(huán)孢素A Sigma Product No. C1832 ）
③  分兩孔，2ml/孔加至24孔板中（如果分離的血量大，請(qǐng)酌情考慮加入25cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)），37℃，5％CO2培養(yǎng)
④  一般24h后即可見到細(xì)胞聚集成團(tuán)生長(zhǎng)，3-5天可見液體PH值發(fā)生變化，呈橙黃色，早期視情況補(bǔ)液，待細(xì)胞生長(zhǎng)良好再采用半量換液（培養(yǎng)基為 20％FBS-1640全培，含0.2 μg/ml cyclosporin A）
⑤  一般15天左右即可建立穩(wěn)定生長(zhǎng)的淋巴母細(xì)胞。