關鍵詞:探針合成技術服務|實驗技術服務
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探針合成技術服務|實驗技術服務——pCzn1質粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系。
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產品品牌：探針合成技術服務|實驗技術服務   http://xyxwjj.cn/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html
測序實驗流程：
1、  合成cDNA步驟
（1）    加入從卵巢癌細胞或組織中提取的總RNA ≥ 5ug。
（2）    加入 Nuclease-free 水 75 ul
（3）    加入 5x iScript Reaction Mix，按20 ul/ 100ul 比例加入。
（4）    加入 iScript RT，5 ul.
（5）    在pcr儀上，按以下步驟進行加熱：
5 minutes at 25°C；30 minutes at 42°C；5 minutes at 85°C。
儲存在 –20C冰箱。
2、  擴增ERCC2目的片段
（1）   訂購ERCC2引物，序列如下：
F：5'-CCGctcgagGCTCCTGGTCTACTTCCCGTACG-3'
R：5'-ATTTgcggccGCACGCAGCCGCCACTTCACGTAC-3'
（2）   準備反應液：
按以下試劑比例進行反應MIX的配置：
10x reaction buffer                            5 ul (1x)
dNTPs (stock 10 mM)                            1.0 ul (200uM
Forward primer (250uM)                        1.0 ul (0.2 uM)
Reverse primer (250 uM)                     1.0 ul ( 0.2 uM)
cDNA template                             1 ul  (1 ug)
Taq PCR Polymerase enzyme                  0.5 ul
ddH20                                        up to     50 ul
Total                                                50 ul
（3）   PCR 反應過程
1)        準備PCR儀，并檢查是否可用。
2)        打開PCR儀頂蓋，將96PCR板放置在加熱模塊上蓋緊頂蓋；
3)        選擇程序如下：
1cycle：94’C，3 min  
35 cycles： 94’C，30s；62’C，1 min；72’C，1.5 min             
1cycle：72’C，7 min；4’C    forever
（4）   配制瓊脂糖凝膠：
1)   取出干燥的鋪膠板。
2)   稱取2.5g 的瓊脂糖，放入250ml 的容量瓶中，用量筒量取250ml 的1x TAE 加入容量瓶中，輕輕搖晃2－3 下。
3)   將盛有TAE 和瓊脂糖的容量瓶放入微波爐中，高火加熱4min。
4)   小心取出，室溫冷卻5－10min，稍微搖晃混勻，待溶液溫度冷卻到60℃（不燙手為宜），混勻。
5)   將瓊脂糖溶液倒入事先準備膠槽中，將梳子放置在膠槽上，室溫避光放置30min 左右。
6)   待凝膠干燥后備用。
（5）   瓊脂糖凝膠電泳：
1)   準備PCR產物。
2)   取出酶標板,吸取1ul 6x loading buffer，加入酶標板孔底，加入5ul PCR 產物與loading buffer混勻。
3)   將8道移液器調至6ul，吸取樣本點樣電泳，原則是從右向左，從下向上，140v，電泳20min 左右。
4)   將電源斷開，取出瓊脂糖凝膠，放入盛有EB的容器中，泡10min。
5)   將浸泡過的瓊脂糖凝膠放入凝膠成像系統照相，保存膠圖。