關(guān)鍵詞:滑膜細胞原代培養(yǎng)技術(shù)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)
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滑膜細胞原代培養(yǎng)技術(shù)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系。
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測序?qū)嶒灹鞒蹋?br> 方法
1.   將切下的組織在手術(shù)臺上請將標本放入低溫生理鹽水中(靜止)，在手術(shù)完成時將標本放入PBS冰水液中并放入消毒的容器中帶回實驗室。
2.  在超凈臺中將標本放入培養(yǎng)皿中，加入α-MEM洗滌。
3.  獲得組織切開，仔細辨認于關(guān)節(jié)反折處及增生的白色光滑的滑膜組織，附于關(guān)節(jié)軟骨面的增生的血管翳也為滑膜組織(可作另一管消化)，仔細剔除脂肪組織，用α-MEM洗二次(以去除紅細胞)，放在小青瓶中用解剖剪銳性切碎。
4.   用雙倍獲得組織的體積含有4 mg/mlⅠ型膠原酶的α-MEM消化37℃孵育120分鐘(在此期間震動混勻數(shù)次)
5.   30分鐘后收集**管細胞：細胞懸液經(jīng)70 μm細胞濾網(wǎng)過濾，用1500-2000轉(zhuǎn)離心6分鐘，上清為Ⅰ型膠原酶加入未過濾網(wǎng)的組織，繼續(xù)用于消化。
6.   離心管底細胞用α-MEM離心洗滌2次，每次用α-MEM重懸浮后用1500-2000轉(zhuǎn)，離心6分鐘，*后一次用記數(shù)板觀察到有細胞。細胞*終懸浮于含有10%胎牛血清的α-MEM中，接種到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
7.  60鐘后收集**管細胞：細胞懸液經(jīng)70 μm細胞濾網(wǎng)過濾，用1500-2000 rpm離心6分鐘；用α-MEM洗2次，每次用α-MEM重懸浮后用1500-2000 rpm離心6分鐘，*后一次用記數(shù)板觀察細胞并計數(shù)。細胞*終懸浮于α-MEM含有10%胎牛血清中，接種到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
8.   必要時可做第三管細胞收集；并立即作原代滑膜細胞培養(yǎng)。
9.  每2-3天換液一次。
實驗材料：
1. 實驗動物：大鼠、兔，人手術(shù)切除的關(guān)節(jié)等；
2. 清洗液：不含Ca2+ 和Mg 2+ 的1×PBS，添加100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素，pH7.2；
3. 培養(yǎng)液：RPMI1640培養(yǎng)基，補加15%小牛血清；
實驗方法：
1. 將大鼠處死后，用75%酒精消毒；
2. 用手術(shù)剪剖開其四肢皮膚與肌肉，暴露長骨兩端的關(guān)節(jié)，取出關(guān)節(jié)面滑膜組織置于盛有緩沖液的培養(yǎng)皿中；
3. 剔除滑膜組織外層結(jié)構(gòu)及周邊軟骨組織，用緩沖液洗2—3次；
4. 將滑膜組織置于盛有少量小牛血清的培養(yǎng)皿中，剪碎成1mm×1mm×1mm大小的植塊；
5. 將制備的植塊接種到螺旋口培養(yǎng)瓶中。反轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使植有組織塊的一面朝上，加入培養(yǎng)液，蓋好瓶蓋。將培養(yǎng)瓶放入含5%CO2的培養(yǎng)箱中在37℃條件下進行培養(yǎng)；
6. 培養(yǎng)4h后，組織塊較牢黏附于瓶底時，再輕輕反轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，繼續(xù)培養(yǎng)；
7. 培養(yǎng)3d后換培養(yǎng)液。
注意事項
1.   用0.25% trypsin或0.25% trypsin＋ 0.02% EDTA 或 collagenaseⅠ或collagenaseⅡ消化細胞或合用，只有單用collagenaseⅠ有用、*好；
2.   機械法很難獲得細胞；
3.  全培用α-MEM或RPMI1640或DMEM，加10%胎牛血清。不能用小牛血清，胎牛血清用國產(chǎn)即可；
4.  必須用Ca2+-free的PBS。