關(guān)鍵詞:Southern Blot技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
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Southern Blot技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
我們具備豐富的蛋白表達(dá)設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)操作技巧，承諾客戶不成功不收費(fèi)。在獲得重組蛋白產(chǎn)品的同時(shí)，我們也會提供相應(yīng)的原始數(shù)據(jù)和原始圖片,不需要再額外花費(fèi)精力重復(fù)實(shí)驗(yàn)。另一方面，我們所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)真實(shí)可信，我們提供原始的表達(dá)菌株和克隆質(zhì)粒，客戶可以依據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)報(bào)告重復(fù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
產(chǎn)品品牌：Southern Blot技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)   http://xyxwjj.cn/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html
測序?qū)嶒?yàn)流程：
一、 待測核酸樣品的制備
(一)制備待測DNA
基因組DNA是從動物組織(或)細(xì)胞制備。1.采用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)試劑裂解細(xì)胞，或者用組織勻漿器研磨破碎組織中的細(xì)胞;2.用蛋白酶和RNA酶消化大部分蛋白質(zhì)和RNA;3.用有機(jī)試劑(酚/氯仿)抽提方法去除蛋白質(zhì)。
(二) DNA限制酶消化
基因組DNA很長，需要將其切割成大小不同的片段之后才能用于雜交分析，通常用限制酶消化DNA。一般選擇一種限制酶來切割DNA分子，但有時(shí)為了某些特殊的目的，分別用不同的限制酶消化基因組DNA。切割DNA的條件可根據(jù)不同目的設(shè)定，有時(shí)可采用部分和充分消化相結(jié)合的方法獲得一些具有交叉順序的DNA片段。消化DNA后，加入EDTA，65℃加熱滅活限制酶,樣品即可直接進(jìn)行電泳分離，必要時(shí)可進(jìn)行乙醇沉淀，濃縮DNA樣品后再進(jìn)行電泳分離。
預(yù)雜交(prehybridizafion)
(一) 配制預(yù)雜交液:6XSSC，5XDenhardt's試劑，0.5%SDS，50%(v/v)甲酰胺，ddH2O，100ug/ml鮭魚精DNA變性后加入。注:1.每平方硝酸纖維素膜需預(yù)雜交液0.2ml。2.預(yù)雜交液制備時(shí)可用或不用poly(A)RNA。3.當(dāng)使用32P標(biāo)記的cDNA作探針時(shí)，可以在預(yù)雜交液或雜交液中加入poly(A)RNA以避免探針同真核生物DNA中普遍存在的富含胸腺嘧啶的序列結(jié)合。4.按照探針、靶基因和雜交液的特性確定合適的雜交溫度(Thyb)。(如果使用標(biāo)準(zhǔn)雜交液，靶序列DNA GC含量為40%，則Thyb為42℃。)
(二)把預(yù)雜交液放在滅菌的塑料瓶中，在水浴中預(yù)熱至雜交溫度。
(三)將表面帶有目的DNA的硝酸纖維素濾膜放入一個稍寬于濾膜的塑料袋，用5-10ml2×SSC浸濕濾膜。
(四)將鮭魚精DNA置沸水浴中10min，迅速置冰上冷卻1-2min，使DNA變性。
(五)從塑料袋中除凈2×SSC，加入預(yù)雜交液，按每平方濾膜加0.2ml。
(六)加入變性的鮭魚精DNA置終濃度200μg/ml。
(七)盡可能除凈袋中的空氣，用熱封口器封住袋口，上下顛倒數(shù)次以使其混勻，置于42℃水浴中溫育4h.
Southern雜交
(一)原理
轉(zhuǎn)印后的濾膜在預(yù)雜交液中溫育4-6h，即可加入標(biāo)記的探針DNA(探針DNA預(yù)先經(jīng)加熱變性成為單鏈DNA分子)，即可進(jìn)行雜交反應(yīng)。雜交是在相對高離子強(qiáng)度的緩沖鹽溶液中進(jìn)行。雜交然后在較高溫度下用鹽溶液洗膜。離子強(qiáng)度越低，溫度越高，雜交的嚴(yán)格程度越高，也就是說，只有探針和待測順序之間有非常高的同源性時(shí)，才能在低鹽高溫的雜交條件下結(jié)合。
(二) 步驟
1.將標(biāo)記的DNA探針置沸水浴10min，迅速置冰上冷卻1-2min，使DNA變性。
2.從水浴中取出含有濾膜和預(yù)雜交液的塑料袋，剪開一角，將變性的DNA探針加到預(yù)雜交液中。
3.盡可能除取袋中的空氣，封住袋口，滯留在袋中的氣泡要盡可能地少，為避免同位素污染水浴，將封好的雜交袋再封入另一個未污染的塑料袋內(nèi)。
4.置42℃水浴溫育(至少18h)。
結(jié)果注意:
在膜上陽性反應(yīng)呈帶狀。實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意以下問題:轉(zhuǎn)膜必需充分，要保證DNA已轉(zhuǎn)到膜上。雜交條件及漂洗是保證陽性結(jié)果和背景反差對比好的關(guān)鍵。洗膜不充分會導(dǎo)致背景太深，洗膜過度又可能導(dǎo)致假陰性。若用到有毒物質(zhì)，必需注意**及**。
主要應(yīng)用:
1.遺傳病診斷
2.DNA圖譜分析
3.檢測樣品中的DNA及其含量
4.PCR產(chǎn)物分析